Het verhaal gaat over Prinses Rapunzel, die als baby uit haar kasteel ontvoerd werd door de slechte Moeder Gothel die haar opsluit in een hoge toren zonder deur. Als Madame Gothel naar boven wil komen roept ze: 'Rapunzel, Rapunzel, gooi je haren naar beneden' en dan klimt ze langs de lange betoverde blonde haren van Rapunzel omhoog. Rapunzels haar is behalve erg lang, ook bijzonder. Het licht op als ze zingt, en ook heeft het genezende gaven. Madame Gothel blijft jong door het haar van Rapunzel. Het werkt echter alleen als het nog aan het hoofd van Rapunzel zit, zodra het wordt geknipt verliest het zijn gave.

Rapunzel heeft al jaren maar één wens, ze wil graag naar de 'zwevende lichtjes', die elk jaar op haar verjaardag aan de hemel verschijnen. Moeder Gothel verbiedt het haar, omdat volgens haar de buitenwereld alleen maar slecht is. In werkelijkheid wil ze niet dat iemand erachter komt dat zij Rapunzel als baby heeft ontvoerd en wat voor krachten Rapunzel's haar heeft.

Op een dag komt Flynn Ryder, een vrijbuiter, langs de toren en klimt naar boven om zich te verstoppen voor zijn belagers. Hij heeft zojuist uit het kasteel van de koning en koningin de kroon gestolen. In de toren ontmoet hij Rapunzel, die met hem een deal sluit. Hij brengt haar naar de zwevende lichtjes en daarna weer thuis, en dan krijgt hij de kroon terug. Gewapend met een koekenpan en haar kameleon Pascal gaan ze op pad.

Madame Gothel komt er al snel achter dat haar Rapunzel is verdwenen, en gaat achter het duo aan.

Onderweg belanden ze in een herberg vol met dieven, waar Rapunzel alle criminelen kan overtuigen dat ze hun dromen moeten naleven. Ook komen ze Maximus tegen, het paard van de koning die een hekel heeft aan Flynn. Rapunzel sluit vriendschap met het paard, en samen reizen ze verder naar het kasteel.

Madame Gothel komt ook nog langs, als Flynn even weg is. Zij overtuigt Rapunzel ervan dat Flynn alleen aardig doet, omdat hij de kroon terug wil. Om het te bewijzen geeft ze de kroon aan Rapunzel, die hen zo op de proef kan stellen.

Uiteindelijk bereiken ze het kasteel, en samen met Flynn ziet Rapunzel eindelijk de 'zwevende lichtjes' in het echt. Flynn krijgt van Rapunzel de kroon terug, maar legt hem weg omdat hij vindt dat Rapunzel belangrijker voor hem is. Als ze aanmeren wordt Flynn in de val gelokt door Madame Gothel, die op deze manier Rapunzel terug in de toren wil krijgen. Rapunzel keert verslagen terug met Madame Gothel naar de toren. Flynn wordt gevangengenomen door de bewakers van het kasteel.

In de toren krijgt Rapunzel de ingeving dat zij de verdwenen prinses is. Ze confronteert Madame Gothel ermee, die haar vervolgens gevangen wil houden aan een ketting. Ondertussen in het kasteel lukt het Flynn te ontsnappen uit de handen van de bewakers, met hulp van Maximus en de mannen uit het cafe.

Hij keert met Maximus terug naar de toren van Rapunzel. Daar valt Madame Gothel hem aan, waarna Rapunzel haar belooft altijd naar haar te luisteren, als ze Flynn maar mag redden. Op het moment dat ze boven hem hangt, snijdt Flynn haar lange blonde haren af. Madame Gothel wordt in één klap een oude vrouw, en valt uit de toren. Rapunzel huilt omdat ze Flynn niet meer kan redden met haar haren. Haar traan heeft op dat moment ook een genezende gave, en Flynn wordt weer beter.